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龜鹿益神顆粒對慢性疲勞模型大鼠認知行為及大鼠皮質(zhì)和海馬神經(jīng)顆粒素表達的影響
摘要：目的觀測慢性疲勞（CFS)模型大鼠認知的行為水平變化，探索龜鹿益神顆粒對慢性疲勞綜合征發(fā)揮干預作用的 機制。方法雄性SD大鼠60只，隨機分為空白組，模型對照組,蓯蓉益腎顆粒對照組、龜鹿益神顆粒低劑量組、龜鹿益神 顆粒中劑量組、龜鹿益神顆粒高劑量組，共6組,每組各10只。除空白組外，其它各組用力竭游泳、慢性束縛雙重復合應(yīng) 激構(gòu)建慢性疲勞大鼠模型，前后造模14 d,隨后，空白組，模型組每天給予生理鹽水灌服,其它各組給予相應(yīng)藥物灌服，應(yīng) 用Morris水迷宮實驗評價大鼠其認知行為水平，末次灌胃24 h后解剖大鼠并取材，取大鼠前腦皮質(zhì)及海馬等組織，采用 蛋白印跡（Westem blotting, WB)試驗方法分別測定大鼠皮質(zhì)及海馬中神經(jīng)顆粒素（Ng)蛋白表達結(jié)果。結(jié)果造模成功 及給藥后，Morris水迷宮實驗：與模型組相比，重復測量第4天起，龜鹿益神顆粒中、高劑量組及蓯蓉益腎顆粒對照組的逃 避潛伏期明顯減低（P<〇. 01);穿越平臺次數(shù)明顯升高（P<〇.〇5)。神經(jīng)顆粒素蛋白表達水平：和模型組相比較，蓯蓉益 腎對照組、龜鹿益神低、中、高劑量各組Ng表達水平明顯升高（P <0.05);和蓯蓉益腎顆粒對照組比較，龜鹿益神顆粒中、 高劑量組的Ng表達水平明顯升高（P <0. 05)。結(jié)論龜鹿益神顆粒能夠明顯改善慢性疲勞模型大鼠認知行為水平，并提 高神經(jīng)系統(tǒng)中，Ng蛋白的表達，其二者間的關(guān)系可能是該藥對慢性疲勞綜合征發(fā)揮治療作用的機制之一。
關(guān)鍵詞：慢性疲勞綜合征；龜鹿益神顆粒；神經(jīng)顆粒素 DOI 標識：
美國疾病控制中心（CDC)于1988年命名了慢性疲勞綜合征 (Chronic Fatigue Syndrome, CFS),其突出癥狀是持續(xù)不能改善的 疲憊感，并以低熱、頭痛、咽痛、肌痛、記憶力衰退、注意力難以集 中、抑郁和睡眠功能障礙為其非特異性表現(xiàn)1。并且CDC在 1994年重修慢性疲勞綜合征診斷標準的時，將認知功能障礙作 出詳細定義，主要為注意力集中困難和短期記憶障礙2]。CFS其 臨床特征符合中醫(yī)學中“虛勞’ “虛損’“臟躁’“健忘”等范疇，其 中我們在長期臨床工作中觀察到，以持續(xù)疲勞伴有記憶力減退等 認知功能障礙的CFS患者多見以腎精虧虛為本病的主證，患者 常可見到精神萎頓，眼神渙散、反應(yīng)遲鈍、四肢無力、記憶力減退， 同時或見腰膝酸軟或冷痛，四肢不溫，xing欲淡漠、頭昏目眩、舌淡 少苔，脈沉弱等腎精虧虛證候的表現(xiàn)，在治療中以‘‘補腎填精、充 養(yǎng)髓海”為原則，常應(yīng)用龜鹿益神顆粒加減施治，取得較滿意療 效。遂本研究通過“慢性束縛+力竭游泳”的復合應(yīng)激造模方 法，進行大鼠模型構(gòu)建,并應(yīng)用Morris水迷宮測定逃避潛伏期及 撤除站臺后穿越原站臺所在區(qū)域的頻數(shù)來評價研究對象的認知 功能變化水平,并觀察龜鹿益神顆粒對慢性疲勞大鼠認知水準的
改善及皮質(zhì)和海馬中神經(jīng)顆粒素（Ng)的定量表達水平的改善， 以期對該方藥干預治療CFS的機制及效用作出初步探索。
1材料、儀器與方法
1.1動物及分組SPF級雄性SD大鼠60只，體重（240 ± 20) g， 隨機分為6組：空白組（正常組），模型對照組，蓯蓉益腎對照組， 龜鹿益神低劑量組，龜鹿益神中劑量組，龜鹿益神高劑量組，每組 10只。
1.2藥物龜鹿益神顆粒方藥組成及規(guī)格如下：人參顆粒2. 5g x1袋;枸杞顆粒4gx1袋;醋龜板顆粒0.5gx1袋;鹿角霜顆粒 0.5gx1袋;仙鶴草顆粒1gx1袋;仙鶴草約相當于飲片15g,余 各顆粒均等效于飲片約10g,來源自江陰天江藥業(yè)所產(chǎn)中藥小包 裝顆粒劑。蓯蓉益腎顆粒：內(nèi)蒙古蘭太藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)， 產(chǎn)品批號:16091601,國藥準字Z20030099,規(guī)格每袋裝2g。水合 氯醛。
1.3試劑和儀器試劑：RIPA裂解液：北京索來寶公司，貨號 R0020;—抗:Neurogranin,北京博奧森，貨號 bs - 1143R;內(nèi)參：|3 -actm單克隆抗體，購自中杉金橋公司，貨號TA -09;二抗:辣根 標記山羊抗兔IgG抗體，購自中杉金橋公司，貨號ZB2301; ECL 發(fā)光試劑盒：中杉金橋公司，貨號sc - 2048; PVDF膜：Millipore公 司，貨號IPVH00010;X射線膠片：Carestream公司，型號XBT。
儀器：稱量天平：Sartorius公司，BP310P型；低溫高速離心 機:Eppendorf 公司，centrifuge5417R 型；超低溫冰箱：SANYO 公 司，MDF - U72V型;超純水儀:北京康銘泰克科技發(fā)展有限公司， 蛋白濃度定量儀：Eppendorf公司，22331 hamburg型；電泳儀：北 京六一公司，DYCZ -24DN型；半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)：ATTO公司， WSE -4040型；轉(zhuǎn)移脫色搖床：海門其林貝爾儀器,TS -8型；移 液器:Eppendorf公司；分析儀器：Tanon公司，Ta600型。Mor- ris水迷宮系統(tǒng)：上海欣軟信息科技公司；XR - XM101型。
1.4造模及給藥方法采取冷水力竭游泳、慢性束縛的方法制備 CSF模型。慢性束縛:將大鼠置于自制束縛筒（選用圓柱形塑制 瓶，長18 cm,內(nèi)徑約6cm,前緣為漏斗樣通氣口，內(nèi)徑為1.5 cm， 束縛筒尾端為活動封蓋，大鼠束縛過程可正常呼吸），使其活動 受限。慢性束縛起始時間30min/d,每3天加量15min,逐漸加量 至90min,以免大鼠逐漸順應(yīng)3。力竭游泳：自制80 cm X 65 cm x55 cm泳箱，泳箱四壁光滑，水深約45 cm,超過大鼠身長（包括 鼠尾），水溫20 ±2尤，大鼠頭部沒入水下10 s不能回到水面或泳 姿無力失調(diào)作為其力竭評判標準，每天進行1次4。造模共14 天,正常組不造模，余5組均給予慢性束縛加力竭游泳。造模過 程中，龜鹿益神顆粒低劑量組2只死亡脫落，正常組及龜鹿益神 顆粒中、高劑量組各1只死亡脫落，予以剔除。
模型制備后，給藥階段，正常組和模型組予以生理鹽水灌胃， 10 mlK kg • d),蓯蓉益腎對照組給予相應(yīng)藥物顆粒混懸液灌 胃,417 mgK kg • d);龜鹿益神低、中、高劑量組依次按照1.625 g/ ( kg • d)、. 25 g/ ( kg • d)、6. 5 g/ ( kg • d)制備龜鹿益神顆 粒混懸液,并灌胃，1次/ d,連續(xù)14 d。實驗結(jié)束后，停藥進食12 h后取材，每只大鼠按3 ml/ kg給予10%水合氯醛腹腔注射，麻 醉后，斷頭切取前腦皮質(zhì)及海馬，分別置入凍存管中，放進-20T： 冰柜中備用。
1.5觀察指標
1.5.1認知行為指標Morris水迷宮實驗：實驗設(shè)備為內(nèi)徑約 160cm正圓蓄水池，內(nèi)壁涂黑，約30 cm水深，水溫(20 ±2) T：,將 水域十字均分為均等面積的四個象限，隨機選取任一象限設(shè)置一 站臺，直徑約12cm,站臺隱于水面下1cm,水池正中央上方固定 攝像頭采集圖像，應(yīng)用Ethovision軟件進行后期圖像處理。水迷 宮設(shè)備周遭參照物及光照環(huán)境實驗期間前后一致。定位航行實 • 582 • 驗:給藥后5 d執(zhí)行，從四個象限按隨機象限次序?qū)⒋笫竺娉?池壁置入水中，記錄其在120 s內(nèi)找到隱沒于水下的站臺并駐留 3 s以上所需的時長,即為逃避潛伏期時間。若120 s后大鼠仍未 尋找到站臺，則將其誘導到站臺上，且逗留15 s以上以學習記 憶，并將逃避潛伏期記錄為120 s,取來自不同象限的逃避潛伏期 的數(shù)學平均數(shù)作每日測量數(shù)據(jù)，連續(xù)測量5 d。空間探索實驗:給 藥完成后即定位巡航實驗結(jié)束的第二曰進行，撤去原有站臺，大 鼠隨機象限入水，記錄120s內(nèi)其軀體穿越原站立臺所在區(qū)域的 頻次。
1.5.2蛋白印跡（Westem blotting, WB)試驗方法實驗前大鼠斷 食水12 h,給予每只大鼠100 g/ L的水合氯醛腹腔注射以麻醉,3 mL/ kg,快速取出其前腦皮質(zhì)及海馬組織，在生理鹽水中滌去血 液，用濾紙拭干后，置于-80T：的冰箱中待用。各組分別隨機取 6只大鼠的前腦皮層組織和海馬組織各50 mg,剪碎后于液氮研 磨至細粉末狀，加入RIPA裂解液混勻,4尤低溫存儲箱內(nèi)過夜裂 解。4T：下，12000rpm離心10分鐘，取上清。Eppendorf微量定樣 儀測定蛋白濃度。上樣SDS - PAGE電泳,PVDF膜轉(zhuǎn)移,5%的 脫脂奶粉密閉2h。加入Neurogranin -抗4T：過夜。1 X PBST洗 滌3次，每次10min,將二抗用1 X PBST稀釋3000倍；洗滌一抗 反應(yīng)膜后，將其放入二抗工作液中，孵育1.5h。洗膜，ECL顯影 將膠片掃描后，P - actin作內(nèi)參校正，用TanonGis軟件檢測條帶 灰度值。以同一膜上Ng灰度值與內(nèi)參p -actin灰度值的比值來 反應(yīng)蛋白表達水平。
1.5.3統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0軟件進行處理， GraphPad Prism5. 0Demo軟件作圖，計量資料以均數(shù)±標準差（X ± s)表示，水迷宮實驗中的逃避潛伏期應(yīng)用重復測量的多因素方 差分析進行分析:球形檢驗判斷重復測量數(shù)據(jù)在各個時間點上的 關(guān)系是否滿足Huynh Feldt條件，對不滿足Huynh Feldt條件（P < 0. 05),則采用Greenhouse - Geisser法校正自由度，并應(yīng)用多因素 方差分析每個時間點上的組間差異。余檢測指標均應(yīng)用單因素 方差分析進行統(tǒng)計處理，組間顯著性差異水平為P <0.05。
2結(jié)果
2.2.1定位航行實驗小鼠逃避潛伏期數(shù)據(jù)Mauchly球形檢驗 統(tǒng)計量：W = 0. 617，P = 0. 006 < 0. 01,不滿足球形假設(shè)，采用 Greenhouse - Geisser法對自由度進行修正，結(jié)果顯示時間因素 (day)有統(tǒng)計學意義（F=30.449, P<0.01),各組小鼠逃避潛伏 期隨時間變化而變化的趨勢；時間和分組的交互作用（day* group)有統(tǒng)計學意義（F = 1.72, P <0.05),說明時間因素的作用 隨分組的不同而不同。見圖1。每個時間點上兩組之間兩兩比較 提示：第4天起，和模型組比較，正常組、蓯蓉益腎對照組、龜鹿益 神顆粒中劑量組、龜鹿益神顆粒高劑量組的逃避潛伏期明顯降低 (P<0. 01);第4天，和蓯蓉益腎對照組相比，龜鹿益神中、高劑 量組的逃避潛伏期明顯降低（P <0. 05),第5天，和對照組相比， 龜鹿益神中、高顆粒組逃避潛伏期差異無顯著性意義（P > 0.05)。見圖1及表1。
2.2.2空間探索實驗結(jié)果顯示，和模型組相比，空白組、蓯蓉益 腎對照組、龜鹿益神顆粒低、中、高各組穿越平臺次數(shù)明顯增加
神經(jīng)顆粒素（Ng)是一種由78個氨基酸組成的、具有鈣離子 敏感性的鈣調(diào)蛋白（CAM)結(jié)合蛋白，也是蛋白激酶C(PKC)的突 觸后底物[11]。主要在于人類及哺乳動物的皮質(zhì)、海馬、扣帶回等 組織的神經(jīng)元中的樹突棘高度表達，目前主要學術(shù)觀點認為Ng 通過參與神經(jīng)元突觸的可塑性調(diào)節(jié),從而參與學習記憶等智 能活動的調(diào)節(jié)。主要通過以下幾個方面：首先Ng是PKC的化學 底物,經(jīng)過蛋白質(zhì)磷酸化后發(fā)揮調(diào)控突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體的活 性，活化后的遞質(zhì)受體又可反調(diào)節(jié)以促進Ng的磷酸化，相互增 強,進而使突觸傳遞的效能得到提高；第二，Ng可能是參與學習 記憶活動的主要蛋白激酶的下游靶點，通過自身的磷酸化作用， 參與到蛋白信號傳導通路的調(diào)節(jié)，利于神經(jīng)信號的傳導;再者，長
時程增強（LTP)是海馬區(qū)域持續(xù)加強的突觸聯(lián)系的一種生理活 動，國外大量研究證明，Ng是參與LTP產(chǎn)生和維持的重要物質(zhì)基 礎(chǔ)，可能與改變Ca2+和CaM復合物濃度及相關(guān)蛋白酶活性相 關(guān)12。總之Ng通過參與神經(jīng)遞質(zhì)、蛋白信號通路及長時程增強 的調(diào)節(jié)等諸多途徑，達到調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)和功能上的可塑性， 從而發(fā)揮對學習記憶等智能水平的影響。
本研究證明，多重應(yīng)激因素復合制備慢性疲勞模型大鼠后， 其學習記憶能力明顯減退，同時海馬和前腦皮質(zhì)中神經(jīng)顆粒素的 蛋白表達含量顯著降低（P <0.01),顯示出疲勞應(yīng)激所造成的認 知活動障礙與Ng表達減少具有高度相關(guān)性。應(yīng)用龜鹿益神顆 粒實驗干預及蓯蓉益腎顆粒對照干預后，皮質(zhì)及海馬的Ng蛋白 表達水平明顯升高，大鼠的學習記憶等智能活動能力顯著提 高，表現(xiàn)出水迷宮實驗中逃避潛伏期的降低和撤去平臺后原平臺 停留次數(shù)的增多。同時，在與蓯蓉益腎對照組的比較中，在改善 學習記憶能力和Ng蛋白表達水平上，龜鹿益神中、高劑量組明 顯優(yōu)于對照組即蓯蓉益腎組（P <0.01)。
蓯蓉益腎顆粒由肉蓯蓉、巴戟天、五味子、菟絲子、車前子等 組成，具有填精益髓、補養(yǎng)腎氣的作用，可用于腎氣不足所致的腰 膝酸軟、記憶減退、四肢無力等癥狀。現(xiàn)代藥理研究證明，蓯蓉益 腎顆粒具有顯著的抗氣化抗疲勞的作用，可明顯改善腎虛模型大 鼠的游泳時間及自主活動水平；對戊ba比妥na制備的記憶力障礙 大鼠起顯著的改善智力的作用；并可提高環(huán)磷酰胺所致的免疫力 低下小鼠的免疫功能水平。國內(nèi)學者沈小衍等[13]對符合腎氣虛 辨證分型的30名CFS患者進行前后對照臨床觀察，臨床總有效 率可達86.7%。選取蓯蓉益腎顆粒作為本研究的對照藥物，符 合試驗的設(shè)計要求。
龜鹿益神顆粒是為龜鹿二仙丹加味組成。龜鹿二仙丹出自 《醫(yī)便》卷一，其主要組成為龜板膠、鹿角膠、人參、枸杞，以龜板 膠滋陰潛陽，強腎壯骨，鹿角膠養(yǎng)精育血，溫補肝腎，二藥合而為 君以充精填髓，補虛養(yǎng)精，人參益氣健脾養(yǎng)血，枸杞滋補肝腎，在 原方之上加用仙鶴草扶正補虛，治勞力脫損。共奏充養(yǎng)腎精，益 氣血，補虛勞之功效。明代醫(yī)家形容其組方：“1陰一陽，無偏攻 之憂，入氣入血，有和平之美……精生而氣旺，氣旺而神昌” [14。 本課題前期研究通過隨機對照實驗證實，龜鹿益神顆粒可明顯增 加CFS模型大鼠的力竭游泳時間、曠場實驗中的直立及跨格活 動次數(shù),從而使疲勞大鼠的體力疲勞狀態(tài)得到較明顯好轉(zhuǎn)，并能 明顯增加骨骼肌中過氣化物酶激活受體Y輔激活因子1a (PCG -1a)的含量和血清中IL - 2、阿片肽等含量，從神經(jīng)-內(nèi)分泌- 免疫網(wǎng)絡(luò)和細胞內(nèi)線粒體的再生等方面發(fā)揮調(diào)控效用，從而治療 慢性疲勞[1516。本實驗研究進一步證明龜鹿益神顆粒可明顯改
善CFS大鼠的腦力疲損狀況，提高學習記憶等智能活動水 平。其機制可能與其改善作為智能活動的物質(zhì)基礎(chǔ)之一的 神經(jīng)顆粒素的表達狀況，來參與神經(jīng)突觸可塑性的調(diào)劑，其詳細 機制還有待更進_步的研究揭示，另其與中醫(yī)‘‘腎精”的充養(yǎng)之 間的關(guān)系有望得到進一步的探索和認識。
